El principio de este método es hacer salir los juveniles (J2) que se en-cuentran en estado dormante en los huevos dentro del quiste, mediante el estímulo del exudado radicular que producen las plantas hospedantes. Los J2 al tener contacto con el exudado radicular rompen la pared del huevo y salen del quiste. La finalidad del método es determinar el número de J2 viables por quiste o extraer juveniles y usarlos en inoculaciones u otros estudios. Un método práctico de lograr la eclosión es el siguiente:

- Plantas de S. tuberosum ssp andigena cv. Yungay en macetas

- Plano inclinado

- 2 recipientes de 10 cm de profundidad y 30 cm de diámetro

- 4 tamices de 40 um.

- Papel filtro

- Canastillas de malla de 2 cm de diámetro por 2 cm de altura (pueden ser confeccionadas en trozos de tubo plástico y tela plástica calada)

- Frascos de vidrio de 30 a 50 ml.

- Acido muriático

- Agua destilada

- Pipetas de 5 a 10 ml.

1. Para coleccionar el exudado radicular deposite las macetas con plantas de papa, sobre un plano inclinado, riéguelas y colecte, en el recipiente de 10 cm de profundidad, el agua que ha pasado a través del suelo de las macetas y a través del plano inclinado. Haga pasar el agua colectada 2 o 3 veces por las mismas macetas, para obtener un exudado radicular más concentrado.

2. Filtre el exudado radicular a través de 3 ó 4 tamices de 40 u y después a través de papel filtro. El exudado radicular filtrado puede almacenarse a 4 C o en cubos de hielo, de lo contrario pierde su efecto en 4 días.

3. Para desinfectar las canastillas y frascos de vidrio, colóquelos en una solución de ácido muriático (1 parte de ácido y 4 partes de agua) durante 24 horas, enjuáguelos y déjelos secar durante 24 horas para permitir la evaporación del ácido.

4. Deposite 5 a 10 ml de agua destilada en cada frasco de vidrio y una ca-nastilla de malla dentro del frasco. Coloque los quistes (10 como mínimo) dentro de la canastilla de malla e incúbelos a 15-20C.

5. Después de 4 días succione con una pipeta el agua destilada del frasco de vidrio. Los quistes quedan retenidos en la canastilla. El agua succionada colóquela en una placa de Siracusa o de Petri para observar y contar los J2 que pudieron haber emergido de los quistes. Para observar y contar los nematodos use el microscopio de disección y luz indirecta.

6. Agregue 5 a 10 ml de exudado radicular de papa al frasco de vidrio del cual succionó el agua destilada e incube los quistes nuevamente a 15-20C.

7. Succione el jugo radicular como en el paso 5 y repita el paso 6 cada 3 días, durante más o menos 2 meses, hasta que emerjan todos los juveniles.

8. Obtenga el promedio de juveniles por quiste dividiendo el número total de J2 contados entre el número de quistes colocados en la canastilla.

METODO DE CENTRIFUGACION EN AZUCAR

(Cavennes, F. and Jensen, H.J. 1955)

- 300 cc de suelo

- Recipiente graduado de 2 litros

- Espátula

- Tamiz de 500 um

- Recipiente de 2 a 5 litros

- Tamiz de 44 um

- Vaso de 200 ml

- Pisceta

- Centrifugadora con tubos de 100 a 200 ml

1. Coloque 300 cc de suelo en el envase graduado de 2 l y complete con agua hasta 800 ml. Agite bien con una espátula, para desmenuzar el suelo y este se suspenda en el agua. Agregue agua hasta completar 2 l. y agite nuevamente para facilitar la separación de los nematodos de las partículas de suelo.

2. Deje reposar 10’ para que las partículas más grandes de suelo, sedimenten y pase la suspensión a través del tamiz de 500 um, sobre el recipiente de 2 a 5 l. Elimine los restos que han quedado sobre el tamiz de 500 um (piedras pequeñas y restos orgánicos). Deje limpio el tamiz de 500 um.

3. Agite bien, con una espátula, la suspensión que recibió en el recipiente de 2 a 5 l, deje reposar 10’ y pase la suspensión a través del tamiz de 44 um. Mediante una corriente suave de agua, concentre el suelo con los nematodos en un solo lado del tamiz y con una pizeta recójalos en el vaso de 200 ml.

4. Pase la suspensión a un tubo de centrífuga de 100 a 200 cc. Si es necesario complete con agua hasta llenar el tubo. Agite la suspensión y centrifugue a 1000 r.p.m. durante 3.5 minutos. Los nematodos con el suelo quedan en el fondo del tubo, en el tubo queda el agua sin nematodos y en la superficie del agua algunos restos orgánicos. Elimine el agua y los residuos orgánicos.

5. Al mismo tubo que contiene el suelo, agregue la solución de azúcar al 50%, hasta la mitad del tubo. Agite para suspender el suelo y los nematodos. Llene el tubo con la solución de azúcar y centrifugue durante 2.5 minutos. Los nematodos flotan en la solución de azúcar, las partículas de suelo quedan en el fondo del tubo.

6. Pase la solución de azúcar con los nematodos, del tubo de centrífuga, a un tamiz de 44 um e inmediatamente enjuáguelos con agua corriente, para eli-minar el azúcar y evitar que los nematodos se plasmolizen. Concentre los nematodos en un solo lado del tamiz de 44 u. Con una pizeta, recoja los nematodos en una placa Petri o de Siracusa y obsérvelos bajo el microscopio de disección. El método tiene la ventaja de ser rápido, pero el azucar siempre afecta a los nematodos, por lo cual los nematodos obtenidos por este método, no son útiles para montajes al microscopio o para inoculaciones.

1. Sistema reproductor Femenino

Tipos de gonadas de la Hembra:

- Monoprodélfica Pratylenchus

- Diprodélfica Meloidogyne

- Anfidélfica Helicotylenchus

- Anfidélfica refleja Dorylaimido

Partes de la gonada:

- Monodélfica Pratylenchus

- Didélfica ` Tylenchorhynchus

- Anfidélfica refleja Dorylaimido

Monochido

2. Sistema reproductor Masculino

- Partes de la gonada del macho Meloidogyne

- Espículas Meloidogyne

- Machos sin bursa Meloidogyne

- Machos con bursa:

- Leptodera Psilenchus

- Pelodera Tylenchorhynchus

- Trilobada Dolichodorus

- Machos con suplementos Dorylaimido

METODO DE EXTRACCION DE NEMATODOS POR FLOTACION EN AZUCAR Y "SEPARAN" .MODIFICACION DE FLOTACION Y CENTRIFUGACION

En un envase de 4 l llene 1,348 g de azúcar blanca y agregue 3,875 ml. de agua. Aparte disuelva 0.05 gm. de "Separan" en 125 ml de agua a 75º. El Separan es lento en disolverse, no se debe agitar la solución (demora entre 10 y 20 minutos). Una vez que está completamente disuelto agréguele el agua con azúcar para completar 4 l. Nota: No agitar esta solución.

- vaso de 600 ml

- 2 vasos de 100 ml

- vaso de 50 cc

- Batidora de mano, agitador eléctrico o espátula

- Tamices: "a" de 34 mesh = 500 micras

"b" de 325 mesh = 44 micras

Procedimiento:

- Se coloca una sub-muestra bien mezclada de 50 cc en el vaso de 600 ml y se le agrega la solución de azúcar y "Separan" hasta completar 350 ml.

- Agitar durante 10" con la agitadora o espátula; dejar sedimentar durante 2 minutos

- Decantar el líquido sobre el tamiz "a" que está colocado sobre el "b".

- Enjuagar el "a" mientras se encuentra sobre el "b".

- Usando una piseta se enjuagan y trasladan los residuos y nematodos que se encuentran en el tamiz "b" al vaso de 100 ml (+ 50 ml de agua)

- Se agita el contenido del vaso y se deja sedimentar por 5-10"

- Decantar la suspensión con los nematodos sobre otro vaso de 100 ml.

- Este contenido se agita suavemente y se vierte en un reloj de siracusa o placa para realizar la identificación y contaje de los nematodos bajo un microscopio estereoscópico. Si la muestra permanece turbia vuelva a decantar.