PRACTICA 5

I. METODOLOGIA

METODO DE DECANTACION - FILTRO DE ALGODON DE OOSTEMBRINK (1960)

- 50 cc. de suelo

- Tamiz de 500 u

- 1 recipiente de 1 litro (I)

- 1 recipiente de 2 litros (II)

- Espátula (cuchara)

- 3 filtros de algodón de Oostembrink de 19 cm. de diámetro ó 3 filtros para leche.

- Tamiz de 15.5 cm de diámetro y 2 a 3 cm de profundidad

- Disco de vidrio o vidrio de reloj de 4 cm de diámetro

- Tamiz de 16 cm de diámetro y 38.5 u de tamaño de poro y 2 alambres sol- dados como soportes en la parte inferior del tamiz.

- Plato de extracción, niquelado, de acero inoxidable o porcelana, de 20 cm de diámetro y 2 cm de alto.

1. Coloque los 50 cc de suelo en el recipiente I.

2. Agregue 600 ml de agua. Mezcle y agite la suspensión con una espátula, para que los nemátodos se liberen de las partículas de suelo. Deje reposar 5 segundos para que las partículas de suelo sedimenten. Después de los 5 segundos,decante la suspensión del recipiente I, a través del tamiz de 500 u, sobre el recipiente II.

3. Repita el paso 2, por dos veces más. En el recipiente II se tiene entonces una suspensión turbia de aproximadamente 1,800 ml que contiene los nematodos y partículas finas de suelo. Elimine lo que ha quedado en el recipiente I y en el tamiz de 500 u. Para clarificar la suspensión prepare lo siguiente:

4. Coloque 2 filtros sobre el tamiz de 15.5 cm de diámetro y sobre los filtros coloque el anillo de metal, presione el anillo de metal para asegurar y ajustar los filtros. Humedezca los filtros con una presión de agua uniforme, para que no queden espacios de aire entre el tamiz y los filtros. En estos espacios los nematodos no pueden moverse.

5. El tamiz con los filtros humedecidos, se colocan sobre la cruz de metal, en la bandeja de 2 a 3 cm de profundidad, que debe estar llena de agua. Deposite el disco de vidrio sobre los filtros. La suspensión que contiene el recipiente II se agita, se deja reposar 5 segundos y se decanta sobre el disco de vidrio para evitar que los filtros se rompan y obtener una mejor distribución de la suspensión. Cuando se ha terminado de decantar la suspensión, agregue de 5 a 10 ml de agua sobre el disco de vidrio, para remover el material retenido y se deposite sobre los filtros. Si desea, antes de decantar, la suspensión sobre los filtros puede pasarla a través de 1 tamiz de 38u para limpiar aún más la suspensión, después colectar los nematodos y suelo del tamiz y esta suspensión se decanta sobre los filtros.

6. Para que la superficie de contacto del tamiz con la superficie sea limpia, coloque el tamiz de 15.5 cm de diámetro con los filtros, sobre otro filtro, dentro del tamiz de 16 cm de diámetro. Todo este conjunto se coloca, suavemente (para no mover las partículas de suelo), dentro del plato de extracción, conteniendo 100 ml de agua. Es importante no mover la mesa o lugar donde se ha depositado todo el conjunto porque puede moverse las partículas de suelo y la suspensión queda turbia. Los nematodos por actividad propia pasan los filtros, se dirigen al agua del plato de extracción. Las partículas de suelo, quedan retenidas en los filtros y la suspensión con los nematodos es bastante limpia. Los soportes de metal de la parte inferior del tamiz de 16 cm de diámetro, son para evitar que los nematodos puedan moverse con más facilidad y no regresen a los filtros.

7. Después de 24 horas, retire suavemente los tamices con los filtros, colecte del plato de extracción la suspensión con los nematodos y observe bajo el microscopio de disección.

- Tubos de PVC de 10 cm de diametro

- Bandejitas de plastico con un diametro superior de 11 cm y uno inferior de 9 cm.

- Mallas de tela o plástico

- Papel Higiénico

1. Cortar los tubos de PVC en anillos de un ancho de 5 cm. y adaptarlos a las bandejitas de tal modo que no choque con la base de la bandejita, pegar la malla alrededor del tubo.

2. Colocar un pedazo doblado de papel higienico o papel facial sobre la malla de modo que cubra completamente esta.

3. Colocar 50 cc. de suelo dentro del tubo de PVC

4. colocar el tubo de PVC con el suelo dentro de la bandejita

5. LLenar con una pizeta la bandejita de modo que el agua cubra el suelo.

6. Luego de 48 horas retirar el suelo y el agua de la bandejita con los nematodos pasarla por el tamiz de 38 micras.

7. Colectar en una placa petri pequeña los nematodos del tamiz

8. Ver al estereoscopio.

El principio de usado en este método, es hacer secar los quistes para que la masa de huevos del interior de cada quiste se contraiga y deje el mayor espacio con aire. Esto permite que los quistes floten en el agua, mientras que las partículas de suelo sedimentan.

Para separar los quistes del suelo, usando este principio, se explica a continuación dos procedimientos que podrían usarse:

Materiales:

- 50 ml. de suelo seco

- Tamiz de 175 um.

- Recipiente blanco de mas o menos 10 cm. de profundidad y 20 cm. de diámetro, con los bordes inclinados (lavatorio, lavador o ponchera)

- Pincel fino (# 0 ó 1)

- Papel filtro y placas petri

- Contómetro

Procedimiento:

1. Coloque 50 ml.de suelo seco, en el tamiz de 175 u y lávelos cuidado-samente con agua . Lo que ha quedado en el tamiz, deposítelo en el recipiente blanco de bordes inclinados y llene con agua el recipiente hasta mas o menos 3 cm. del borde superior.

2. Los quistes flotan en la superficie del agua y se dirigen a los bordes del recipiente blanco. Por su color marrón contrastan con el recipiente y pueden ser extraídos con el pincel.

3. En la placa de petri coloque un disco de papel filtro rayado en lineas o en cuadriculas, humedézcalo y deposite sobre este papel, los quistes colectados con el pincel.

4. Observe bajo el microscopio de disección, la placa de petri con los quistes. Use iluminación directa (de arriba hacia abajo) y cuente los quistes con el contómetro.

Materiales:

- 50 ml. de suelo seco

- Tamiz de 175 u de tamaño de poro

- Tira de papel o cartulina blanca de 10 cm. de ancho y 25 cm. de largo y un clip.

- Vaso de vidrio de 10 a 12 cm. de profundidad.

- Pincel Nro. 0 a 1

- Contómetro

Procedimiento:

1. Coloque 50 ml. de suelo seco en el tamiz de l75 u y lávelos cuida-dosamente con agua.

2. Enrrolle la tira de papel o cartulina, asegure los bordes con el clip y colóquela en el interior del vaso de vidrio,de manera que circunde los bordes.

3. Vierta lo que ha quedado en el tamiz de 175 u, sobre el vaso de vidrio y llene el vaso con agua, hasta mas o menos 3 cm. del borde superior del vaso.

Procedimiento C :

Materiales:

- 50 ml. de Suelo.

- Botella transparente de Pico angosto.

- Papel filtro y placas petri.

- Contómetro.

Procedimiento

- Coloque 50 ml. de suelo seco en la botella.

- Agrege agua hasta la mitad de la botella, agite bien y llene con agua hasta 1 cm del pico.

- Transfiera los quistes y la materia orgánica que han flotado en el pico al papel filtro rayado en lineas o en cuadritos.

- Cuente los quistes bajo el esteroscopio con el contómetro.

II. MORFOLOGIA

1. Fenestras

- Circumfenestra Globodera sp.

- Ambifenestra Heterodera schactii

- Bifenestra Heterodera avenae

- Dos fenestras Punctodera sp.

- Punctuaciones Meloidogyne hapla

2. Tipos de Estomas

- Cilindrico Rhabditido

- Ensanchado Mononchido

- Odontoestilete corto Dorylaimus

- Odontoestilete largo Xiphinema sp.

- Estomatoestilete corto Pratylenchus sp.

- Estomatoestilete largo Belonolaimus sp.

- Onchioestilete Trichodoridos

III. CONTROL

Determinar el efecto de la enmienda orgánica del suelo en la reproducción del nematodo y en el crecimiento de la planta de tomate.

- Plántulas de tomate de 5 cm. de altura

- Macetas de 500 cc de capacidad

- Suelo estéril

- Huevos de Meloidogyne incognita (2,500/maceta)

- Estacas, reglas y pitas

- Bomba de pecera

1. Suelo sin materia orgánica y sin Meloidogyne

2. Suelo sin materia orgánica y con Meloidogyne

3. Suelo con 5 gr. de materia orgánica y sin Meloidogyne

4. Suelo con 5 gr. de materia orgánica y con Meloidogyne

5. Suelo con 10 gr. de materia orgánica y sin Meloidogyne

6. Suelo con 10 gr. de materia orgánica y con Meloidogyne

Nº de repeticiones = 3 Total de macetas = 18

- Hacer un almácigo de tomate en grava vermiculita por lo menos 15 días antes del transplante

- Transplantar las plántulas de tomate a las macetas conteniendo el suelo con o sin la materia orgánica.

- Extraer huevos de Meloidogyne de raíces infectadas, mediante el método de hipoclorito de sodio al 0.5 % .

- Contar el número de huevos/ml. de 2 submuestras.

- Calcular el número de militros a colocar por maceta

- Remover un poco el suelo de la maceta, verter la suspensión de huevos, tratándo de esparcirla uniformemente en la superficie del suelo, cubriendo la maceta con una capa de suelo y regarlo suavemente.

- Altura de la planta a los 30 y 60 días después de la inoculación.

- Peso del follaje y peso de raíces a los 60 días después de la inoculación.

- Indice de nodulación ó número de masas de huevos a los 60 días después de la inoculación.

- Población final del nematodo a los 60 días de la inoculación, mediante el método de extracción de huevos de hipoclorito de sodio.