Los métodos más comunes de tinción son fucsina ácida lactofenol y el método de Azul de Algodón - Lactofenol.

Método de Fucsina ácida-lactofenol

- Raíces infectadas libres de suelo

- Lactofenol puro:

fenol líquido ................. 100 ml

ácido láctico ................. 100 ml

glicerina ..................... 20 ml

agua destilada ................ 100 ml

- Fucsina ácida-Lactofenol

A la cantidad de lactofenol puro que desee agregue cristales de fucsina ácida (lo que enrojecerá el líquido) hasta una concentración de 0.1 % .

1. Lave cuidadosamente las raíces sumergidas en agua para librarlas del suelo.

2. La tinción se puede hacer caliente o fría. Primero podría tratarse la tinción fría, para lo cual el tejido vegetal se transfiere directamente a fucsina ácida-lactofenol al 0.1 %. Se deja allí 12 ó 24 horas dependiendo del grosor del material vegetal. Si no se obtienen buenos resultados con la tinción fría se puede tratar con la tinción caliente, para lo cual se sumerge y hierbe por un minuto el material vegetal en fucsina ácida- lactofenol 0.1%.

3. Después de la tinción fría transfiera el material teñido directamente a lactofenol puro para clarificar el tejido vegetal. Después de la tinción caliente transfiera el material vegetal teñido a un recipiente conteniendo agua y lávelo con agua en circulación para eliminar el exceso de tinte. Transfiera el material vegetal teñido a lactofenol puro para clarificar el tejido vegetal.

4. Después de algún tiempo que puede ser 3 días o un mes, el material estará listo para su observación. Los nematodos que estarán teñidos pueden ser vistos dentro del tejido vegetal.

5. Los nematodos teñidos pueden ser montados en porciones de tejido vegetal en lactofenol puro o pueden ser disecados del material vege-tal y montados en lactofenol puro, pero los porta-objetos deben llevar un anillo de parafina, glicel o esmalte de uñas para sostener el cubre-objeto. El cubre-objeto se coloca sobre este anillo y así no se aplasta los nematodos.

6. Las partes del cubre y porta-objeto que van a ser selladas límpielas con un isopo pequeño de algodó humedecido en etanol de 100 % . Fije el cubre-objeto con tres gotas pequeñas de glicel o esmalte de uñas mediante un pincel de pintar. Después de 24 horas vuelva a aplicar glicel a todo el contorno del cubre-objeto.

7. Anotar en el montaje permanente:

- El nombre específico del nematodo

- El número, sexo o estado del nematodo

- El método de montaje

- Lugar del que se extrajeron los nematodos (suelo y el cultivo)

- Número de slides en su colección

- Iniciales del nombre de la persona que realiza el montaje

- La fecha del montaje

MÉTODO DE TINCION EN FUCSINA ACIDA-HIPOCLORITO DE SODIO

Este método tiene la ventaja de no exponerse al fenol, que es una sus-tancia tóxica.

Solución colorante Fucsina Acida-Acido Acético.

Agua destilada: 200 ml

Acido Acético 1 ml

A la solución anterior agregue cristales de fucsina ácida hasta alcanzar una concentración de 0.1%.

Procedimiento:

Lave las raíces infectadas y colóquelas en un beaker o vaso.

Clarifique las raíces agregando 50 ml de agua de caño mas 10 ml. de hipo- clorito de sodio al 5.25%.

Sumerga las raíces en esta solución durante 4 minutos y agite ocacional- mente.

Lave las raíces por aproximadamente 45 seg en agua circulante y remójelas en agua de caño durante 15 min para eliminar cualquier residuo de hipo- clorito de sodio. Colóquelas por un momento sobre papel toalla para eli- minar el exceso de líquido.

Transfiera las raíces a un vaso conteniendo la cantidad necesaria de la solución colorante. Deje las raíces en esta solución por un día o más de- pendiendo del grosor de las raíces.

Coloque las raíces en una cantidad suficiente de glicerina acidificada con unas cuantas gotas de 5N HCL.

 

PROCESO DE MUERTE FIJACION, Y MONTAJE DE NEMÁTODOS (Método de Seinhorst)

MUERTE

1. Colecte los nemátodos en una gota de agua sobre una luna de reloj.

2. Coloque en un tubo de vidrio cerrado, una mezcla de formalina y ácido propiónico en la proporción 4:1 y caliente a Bano María (90°C). En otro tubo tenga formalina al 4%. En lugar del ácido propiónico puede usar ácido acético (80°C).

3. Agregue a la una de reloj que contiene la gota de agua con los nemátodos, 5 cc de FP 4:1, caliente a 90°C e inmediatamente agregue 50 cc. de for-malina al 4%.

FIJACION:

1. Después de matar los nemátodos, transfiéralos a una placa de fijación con formalina al 4%. Tape la placa con una laminilla cubreobjeto y guárdela en una placa petri conteniendo en el fondo, papel filtro humedecido en formalina al 4%. Mantenga los nemátodos en este lugar por 10 a 15 días. Después de matar el protoplasma sin causar distorción, los diferentes te- jidos debes ser deshidratados y endurecidos para que los nemátodos pue- dan ser montados. La deshidratación se realiza con la finalidad de faci- litar la penetración de glicerina,no soluble en agua, dentro de los te- jidos del nemátodo, esto se consigue mediante los siguientes pasos:

- Transfiera los nemátodos de la placa de fijación con formalina al 4%, a otra placa de fijación conteniendo la solución SEINHORST I:

SEINHORST I :

Etanol al 96%...........26 partes

Glicerina...............1 parte

Agua destilada..........73 partes

3. Tape la placa de fijación con una laminilla cubreobjeto y colóquela en un vaso conteniendo exceso de etanol de 0.6 % (mas o menos la mitad del vaso). Cierre herméticamente el vaso y deposítelo en una incubadora a 35- 40°C por 16 hrs.

4. Al cabo de 16 hrs. con una micropipeta, saque la solución de la placa de fijación, chequeando bajo el estereoscopio que los nemátodos no sean sacados y llénela con la solución SEINHORST-II

SOLUCION SEINHORST II:

Glicerina deshidratda.............7 partes

Etanol 96%........................93partes

5. Tape la placa de fijación con un cubreobjeto y colóquela en una placa petri. Guarde la placa petri en una incubadora a 30-40°C.

Después de 3 horas agregue a la placa de fijación una gota de glicerina deshidratada, tapéla con la laminilla cubreobjeto y déjela en la incu- badora 35-40°C.

6. Al día siguiente retire la laminilla cubreobjeto y después de 4 a 5 hrs. Coloque la placa de fijación en un desecador con CaCl2 o silica gel por 4-5 días.

MONTAJE:

1. Transfiera los nematodes procesados a glicerina deshidratada.

2. Limpie el cubre y portaobjeto con etanol al 96%. Coloque una gota de glicerina deshidratada sobre el portaobjeto.

3. Coloque los nemátodos a montar en el centro de la gota de glicerina y en posicion radial a la gota. Tres fibras de vidrio de diámetro similar al de los nemátodos. Deposite suavemente una laminilla cubreobjetos tibia para que no quede burbujas de aire. El cubre objetos queda sobre las fi- bras de vidrio las que impiden que los nemátodos sean presionadoa por el cubreobjetos.

4. Si la gota no llena el cubreobjeto, se puede añadir glicerina deshi- dratada. Si lo sorepasa retire el exeso con pedazos de papel filtro.

5. Las partes del porta y cubreobjetos que van a ser sellados limpielas con un isopo de algodon humedecido en etanol al 100%. Fije el cubreobjeto con tres gotas de glicel aplicados en tres puntos distintos. despues de 5 mi- nutos selle completamente con glicel mediante un pincel. Despues de 24 horas vuelva aplicar glicel en el contorno.

6. Rotule en el montaje permanente:

Nombre específico del nemátodo.

Numero y sexo.

El metodo de montaje

Lugar del que se extrajeron los nemátodos (Suelo y cultivo)

Numero de Slide en su colección

Iniciales del nombre de la persona que realiza el montaje.

FIJACION Y DESHIDRATACION DE NEMÁTODOS (Método de Golden)

Materials:

- Solución fijadora : 3% de formaldehido + 2% de glicerina

+ 30 ml. de formalina (37%)

+ 350ml. de agua destilada.

+ 7.6 ml. de glicerina

Preparar cualquier cantidad de la solucion fijadora manteniendo las pro-porciones indicadas, y manteenga en botella cerrada a 43 C

- Plaquita de vidrio para fijar.

- Incubadora a 43 C

- Solución saturada de acido picrico.

- Glicerina deshidartada y mantenida a 43 C.

1. Coloque los nemátodos en una plaquita de vidrio en 2 ó 3 gotas de agua. Coloque la plaquita de vidrio en la estufa a 45 C.

2. Despues de 12 minutos, vierta fijador tibio a (43 C) hasta llenar la plaquita de vidrio.

3. Retire la plaquita de vidriodela estufa, cubrala y dejela a temperatura ambiente.(Guardandola cubierta puede permanecer en esta condicion indefinidamente).

4. Despues de 16 a 24 horas o más, agregue dos gotas de solución acuosa sa- turada de ácido picrico, regrese la plaquita cubierta a la estufa y deje- la alli por 8 a 10 semanas. El acido picrico previene el aclareo de la porción basal del estilete.

5. Cada 3 ó 4 dias controle la plaquita de fijación y si es necesario a- gregue fijador para mantenerlo llena.

6. Despues de 6 a 8 semanas ( o un poco mas para tylenchidos) no agregue mas fijador y permita que el líquido se evapore gradualmente,

7. Cuando quede solo glicerina y nemátodos en la placa de fijación, agregue 3 ó 4 gotas de glicerina pura a 43C y déjela en la estufa por dos a tres semanas.

8. Retire la placa de fijación de la estufa y monte los nemátodos en glice- rina deshidratada o coloquelos en frascos de vidrio con glicerina.