JUSTIFICACION

El conocimiento de las estructuras del ser vivo está basado casi totalmente en el estudio con el microscopio. El microscopio óptico es un instrumento que permite la observación de objetos y detalles de estructuras tan pequeñas que no podrían ser observadas a simple vista. Con él, nuestro grado de visibilidad se amplía en cientos o miles de veces, gracias a un conjunto de lentes, dispuestos convenientemente. Las principales dificultades en la observación y estudio de estructuras biológicas son su REDUCIDO TAMAÑO Y SU TRANSPARENCIA a la luz visible. Dado que el microscopio permite superar estas dos dificultades, su uso y el conocimiento de los principios y técnicas en microscopía, resultan fundamentales para el desarrollo de la investigación en ciencias biológicas.

OBJETIVOS.

La presente práctica tiene por objetivos:

1. Identificar las partes del microscopio y comprender sus características y la visión con él.

2. Manejar el microscopio correctamente.

3. Realizar una observación con este instrumento.

TIPOS DE MICROSCOPIO A USAR EN EL DESARROLLO DE LAS PRACTICAS

En el desarrollo de las prácticas serán usados 2 tipos de microscopios:

1. El microscopio estereoscópico, el cual es binocular, con aumentos de 4 a 40 veces, permite observar muestras opacas y realizar disecciones de estructuras en organismos pequeños, ya que en él puede manipularse la muestra mientras se observa. Proporciona una imagen tridimensional.

2. El microscopio compuesto, que puede ser monocular o biocular, permite obtener aumentos de 100 a 1500 veces. Los objetos a observar deben ser muy pequeños o cortados en láminas tan delgadas que la luz pueda atravezarlos.Estos se colocan en láminas de vidrio especiales denominadas porta-objetos y cubre-objetos. Las imágenes que se obtienen son bidimensionales e invertidas.

PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. PARTE MECANICA. Comprende los siguientes dispositivos.

1.1 Pie. Base que da soporte y estabilidad al microscopio.

1.2 Columna. Estructura que une el pie con la platina y el tubo. Sostiene además el condensador y el diafragma.

1.3 Platina. Superficie plana para sostener el porta objetos y el cubre-objetos que contienen a las preparaciones.

1.4 Tubo. Proporciona soporte a los lentes oculares y objetivos.

1.5 Cremallera. Asociada a dos tornillos, permite el movimiento vertical del tubo o de laplatina para obtener la distancia a la cual el objeto puede ser observado nítidamente; es decir, el enfoque preciso para el observador.

1.6 Tornillo macrométrico. Permite movimientos muy cortos en un ajuste fino del enfoque para lograr una observación precisa.

1.7 Revólver. Sistema giratorio relacionado con el tubo, que porta los lentes objetivos para diversos aumentos, pudiendo utilizarlos alternativamente.

1.8 Pinzas. Par de láminas rectangulares, situadas sobre la platina, para mantener al porta-objetos.

2. PARTE OPTICA: Comprende los lentes oculares, los lentes objetivos y los dispositivos de iluminación.

2.1 Oculares. Lentes dispuestos en la parte superior del tubo cercano al ojo del observavador. Su aumento puede ser de 6X, 10X y 15X.

2.2 Objetivos. Son lentes de diferentes aumentos situados en el otro extremo del tubo, en el revólver. El de menor aumento es más corto (3.2X,4X, 8X y 10X) y el de mayor aumento es más largo (40X y 44X). Puede existir además un objetivo de inmersión de 100 a 150 aumentos.

2.3 Condensador. Lente que concentra el haz luminoso hacia la preparación.

2.4 Diafragma. Abertura que regula la cantidad de luz que ingresa hacia la preparación.

2.5 Espejo o luz incorporada. Proporciona la luz que llega hasta el objeto a estudiar y el sistema óptico del microscopio. Existe un espejo plano por un lado y cóncavo por el otro, para ser usados cuando se disponga de abundante o escasa luz, respectivamente. La luz incorporada corresponde a un foco de luz eléctrica adaptado en el lugar que ocupa el espejo.

 

 

 

CARACTERISTICAS DE LA VISION CON EL MICROSCOPIO

1. Grado de Aumento: Es la magnificación total que sufre la imagen del objeto debido al efecto de los lentes oculares y objetivos. Se obtiene multiplicando el número de veces que aumenta el lente ocular por el número de veces que aumenta el lente objetivo. Si el objetivo aumenta la imagen de un objeto 40 veces, ésta al pasar por la lente ocular será nuevamente aumentada.

Si el ocular aumenta 10 veces, la magnificación total en este caso será:

10X x 40X = 400X.

Este resultado permite saber cuantas veces más grande estamos viendo la imagen de un objeto.

2. Poder de Resolución. Es la posibilidad de distinguir separados dos puntos muy cercanos entre sí. Cuanto mmayor sea el poder de resolución, menor será la distancia entre dos puntos a la cual pueden distinguirse como tales. La distancia límite en la cual dos puntos pueden ser todavía distinguibles se denomina Límite de Resolución. El poder de resolución de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda de la fuente luminosa y de la apertura numérica (propiedad óptica de la lente). Puede ser calculado mediante la siguiente fórmula:

LAMBDA = Longitud de onda de la fuente luminosa

LAMBDA

P.R. = -------

2 A.N.

Donde:

LAMBDA = Longitud de onda de la fuente luminosa

A.N. = Apertura numérica de la lente.

Existe una correspondencia entre el aumento de un objeto y su apertura numérica, de tal modo que las lentes con mayores aumentos generalmente tendrán mayores aperturas numéricas. El poder de resolución es quizá la característica más importante de un buen microscopio ya que de nada sirve una imagen muy grande del objeto, si ésta se ve borrosa y no puede distinguirse en sus detalles.

 

3. Distancia de Trabajo. Es la distancia que existe entre el objeto en observación y el lente objetivo. Esta distancia variará según el aumento de la lente objetivo con la cual se trabaje. Es inversamente proporcional al grado de aumento; es decir, cuanto mayor sea el aumento del lente objetivo menor será la distancia de trabajo. Cuando se trabaje con un lente de inmersión la distancia de trabajo será mínima. En estos casos es necesario usar aceite de inmersión entre el lente objetivo y la preparación debido a que el índice de refracción para este tipo de lente es la del aceite y no la del aire. Esto permite obtener una imagen de gran tamaño y al mismo tiempo de gran nitidez.

 

MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Limpiar el espejo, condensador y los lentes del microscopio.

a. Eliminar el polvo mediante un soplete de aire o pincel fino.

b. Frotar sin presionar, con papel de lente, usando este solo una vez.

2. Comprobar si el lente objetivo de menor aumento está a continuación del tubo; si no es así, debe colocarse en dicha posición haciendo girar el revolver hasta alcanzar un "tope" que lo indique.

3. Abrir completamente el diafragma y observando a través del ocular, mover el espejo orientándolo de modo que la luz reflejada se observe en un círculo uniformemente iluminado.Este constituye el "campo óptico". Una vez obtenida la iluminación máxima, NO SE DEBE CAMBIAR LA POSICION DEL MICROSCOPIO. Con luz incorporada no hay espejo.

4. Ubicar y sujetar el porta-objetos en la platina, procurando que la preparación se halle en el centro de la abertura circular.

5. Mover el tornillo macrométrico para acercar el lente objetivo de menor aumento hacia la preparación, hasta llegar a un tope.

6. Observando por el lente ocular, mover nuevamente el tornillo macrométrico en el sentido inverso hasta que aparezca la imagen.

7. Una vez enfocada la imagen girar el tornillo hasta que sea nítida. Nunca se debe usar el tornillo micrométrico para grandes desplazamientos, para ello está el tornillo macrométrico.

8. Cuando los tornillos macro y micrométrico se encuentren incorporados en un solo dispositivo, el ajuste fino se hace solo después de haber realizado el avance rápido de acercamiento a la preparación.

9. Antes de pasar al siguiente aumento verificar que la imagen a observar se encuentre en el centro del campo, hacer girar el revolver cambiando el lente objetivo hasta llegar al "tope" y accionar solamente el tornillo micrométrico hasta obtener la nueva imagen.

10. Para observar una muestra con el objetivo de inmersión, se coloca una gota de aceite de cedro encima de la lámina de la preparación antes de girar el revolver. Esto pemite que la imagen se vea con nitidez para realizar la observación ya que este tipo de lentes requiere que el índice de refracción sea similar al del vidrio.

11. Terminada la observación, girar el revólver para colocar el objetivo de menor aumento en la primera posición de trabajo.

12. Retirar la preparación y dejar limpio el microscopio, secando la platina con cuidado.

13. Si usó el objetivo de inmersión, debe limpiarse inmediatamente después de su uso con ayuda del papel de lente. Quitar el grueso del aceite con una hoja, luego limpiar con una segunda impregnada en xylol y finalmente con una tercera, secar el lente. No usar cantidades excesivas de solvente pues pueden disolver el cemento de los componentes de los lentes.

14. Mantener cubierto o guardado el microscopio cuando no esté en uso.

15. En sitios con excesiva humedad ambiental deberá guardarse el microscopio en una campana de vidrio con un desecante como carbonato de calcio.

 

De Laboratorio:

- Microscopio Compuesto.

- Microscopio Estereoscópico.

- Muestras de Agua Estancada.

- Goteros.

Del alumno:

- Guía de Estudio.

- Láminas porta-objetos.

- Láminas cubre-objetos.

- Servilleta de algodón, sin almidonar.

Para medir objetos que se observan en el campo visual de un microscopio (Metodología microscópica), se utiliza un micrómetro ocular. Este consiste de una placa de cristal con una escala grabada, que se inserta en un ocular microscópico, quedando la escala enfocada por encontrarse en el plano de la imagen real intermedia.

Es preferible contar con un ocular micrométrico con la placa permanentemente instalada (especialmente si el microscopio es monocular), el cual reemplaza al ocular visual para hacer mediciones. Para mayor precisión se puede utilizar un tipo de ocular micrométrico que tiene una escala exterior adicional en un tornillo micrométrico que en cada vuelta completa desplaza un trazo perpendicular un intérvalo de la escala grabada. Desde que los aumentos de los microscopios varían (cuando son de la misma serie y marca pueden variar ligeramente), las escalas de micrómetros oculares no representan medidas convencionales, sino simples unidades.

Para determinar la distancia lineal que representa cada unidad (el valor micrométrico), se debe hacer calibraciones para cada aumento de un microscopio (o sea los productos de los aumentos de cada combinación ocular-objetivo) utilizando un micrómetro de platina (un micrómetro objetivo). Los micrómetros de platina son similares a una lámina portaobjetos y tienen grabadas escalas que representan medidas exactas y convencionales. Comúnmente se utiliza un micrómetro de platina cuya escala métrica es de un milímetro (1000 micras), dividida en 10 unidades con 10 subdivisiones de 10 micras cada una (la unidad más pequeña representada).

Determinación de Valores Micrométricos

1. Colocar el micrómetro en el ocular del microscopio (o sustituir un ocular por el ocular micrométrico).

2. Enfocar la escala del micrómetro de platina a través del microscopio.

3. Girar el ocular micrométrico hasta que las dos escalas estén paralelas.

4. Mover el micrómetro de platina hasta que el comienzo (extremo izquierdo) de su escala coincida con el de la escala del micrómetro ocular.

5. Ubicar la línea del micrómetro ocular más distante del comienzo de la escala que coincida con una línea de la escala del micrómetro de platina o calcular el largo en micras de la distancia representada en el micrómetro de platina, que corresponde al largo total del micrómetro ocular o de contar con un tambor micrométrico desplazar el trazo perpendicular hasta que coincida con una línea distante del comienzo de la escala de la platina.

Determinar las unidades que éstas representan en ambas escalas.

6. Cálculo del valor micrométrico ( V.M.) en micras

Medida micrómetro de platina, en micras

V.M. = Unidades micrómetro ocular

7. Repetir el cálculo para cada objetivo, usando aceite para el objetivo de inmersión.

8. Preparar una etiqueta con la información adquirida, la cual se adhiere al microscopio, ejemplo:

Objetivo V.M. (micras)

10X 16.70 45X 3.70 93X 1.65

9. Para medir objetos en el campo del microscopio, hacer coincidir un extremo o división mayor de la escala del micrómetro ocular con un extremo del objeto a medir. Contar el número de unidades que representa.